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利用Rosa cymosa 果實萃取物和自Petrosia sp. 海綿分離之xestoquinone 對白血病细胞的抗癌 機制研究

為了解決cxc平台的問題，作者王冠智 這樣論述：

天然物做為輔助藥物與抗癌藥物一起使用已經獲得很多的成果，越來越多的證明指出天然藥物對於治療白癌細胞具有抗癌的作用機制。本研究選擇中草藥Rosa cymosa Tratt. 和取自海綿Petrosia sp的天然物xestoquinone來探討血癌的相關作用機制，本研究論文分成兩個部分，如下： 研究論文的第一部份，小果薔薇是一種中草藥療法，用於治療腹瀉、燒傷，風濕性關節炎和出血。儘管它在亞洲民間醫學中使用，但關於小果薔薇果實的生物活性研究報告有限。本研究重點探討小果薔薇果實抗氧化乙醇提取物之抗腫瘤作用及其作用機制。RCE對Sup T1和Molt 4淋巴芽細胞白血病 (lympho

blastic leukemia cells) 具有很好細胞毒殺活性。在異種移植動物試驗中，小果薔薇乙醇萃取物治療組較對照組相比，腫瘤體積顯著縮小約至59.42%左右。細胞試驗結果顯示，利用各種濃度小果薔薇乙醇萃取物 (37.5、75或150 μg/mL) 處理可誘發26.52%-83.49%的凋亡，破壞線粒體膜電位為10.44%-58.60%，且與對照組比較下，小果薔薇乙醇萃取物可促進鈣離子釋放率提高1.29、1.44和1.71倍。而且，此萃取物處理可誘發癌細胞中產生氧化壓力是藉由清除Nrf2/Keap1/p62以誘導活性含氧物生成。利用siRNA調降小果薔薇乙醇萃取物所誘發PTEN活性化可

提升PI3K/Akt/Foxo及Jak/Stat之腫瘤生成途徑。然而小果薔薇乙醇萃取物多靶點之抗腫瘤機制對血液癌細胞而言，可做為抗白血病膳食補充劑的潛在應用。漢岑黃素為5, 7-dihydroxy-8-methoxy flavone首次從小果薔薇果實分離，利用X射線晶體學確定此化合物之平面結構。然而以分子模擬及西方轉漬分析結果更進一步證實此化合物對於HSP90具有高親和性。 研究論文的第二部份，xestoquinone 是一種多環醌型代謝物，先前研究報導具有抗腫瘤作用。我們測試了 xestoquinone 對一系列血液癌細胞的細胞毒活性。而xestoquinone 的抗白血病作用以in

vitro 和in vivo 等方式進行了評估。這種海洋代謝物抑制癌細胞增殖，其 IC50 分別為 2.95、6.22、8.58 和 11.12 μM，如細胞存活率增殖試驗測定所示。在cell-free試驗中，分別用 0.235 和 0.094 μM 處理後，Topo I 和 IIα的活性抑制了 50%。在 Molt 4 細胞中，流式細胞儀分析表明了xestoquinone 的細胞毒作用是通過誘導多種凋亡途徑來調節的。用 N-acetyl cysteine預處理於 Molt 4 細胞，減少了線粒體膜電位和细胞凋亡的破壞，並保留了 Topo I 和 IIα的表達。與裸鼠異種移植模型中，與對照組相

比，xestoquinone (1 μg/g) 的用藥顯著減少了 31.2% 的腫瘤生長。分子模擬和西方轉漬分析試驗通過對HSP90和Topo I / IIα的高結合親和力驗證了xestoquinone的催化抑制活性。 總結來說，我們進一步研究小果薔薇萃取物並以動物試驗顯示了腫瘤體積顯著縮小的結果，並進行有效成分的分離，使之成為抗血癌藥物的潛力；另一方面，xestoquinone 通過多種途徑靶向血癌細胞，表明其潛在的應用可能被開發為抗癌的先導藥物。

以反向基因工程探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒第一與二型之分子致病機制：分析NLRP3/CXCL10介導發炎反應及高關注變異株感染力

為了解決cxc平台的問題，作者張勇昇 這樣論述：

致謝 I中文摘要 IIABSTRACT IV目錄 VI圖表目錄 XI第一章、 文獻探討 1第一節、 緒論 1第二節、 冠狀病毒屬（Coronavirus genus） 21. 甲型–冠狀病毒（Alpha-coronavirus, α-CoV） 22. 乙型–冠狀病毒（Beta-coronavirus, β-CoV） 33. 丙型–冠狀病毒（Gamma-coronavirus, γ-CoV） 34. 丁型–冠狀病毒（Delta-coronavirus, δ-CoV） 3第三節、 人類冠狀病毒的流行病學（Epidemiology of human coro

navirus） 41. 嚴重急性呼吸道綜合症冠狀病毒–一型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-1, SARS-CoV-1） 42. 中東呼吸道綜合症冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV）…………………………………………………………………………………………………….. 53. 嚴重急性呼吸道綜合症冠狀病毒–二型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2, SARS-CoV-2） 63.1.

SARS-CoV-2高度關注變異株（Variants of Concern,VOCs） 6第四節、 人類冠狀病毒的傳播（Transmission of human coronavirus） 8第五節、 SARS-CoV-1與2的結構與基因組 （Structure and genome of SARS-CoV-1 and 2）…………………………………………………………………………………………… 91. 結構（Structure） 92. 基因組（Genome） 93. SARS-CoV-1與SARS-CoV-2基因組的差異（Sequence identity of SA

RS-CoV-1 and 2）……………………………………………………………………………………………………….. 104. 非結構性蛋白（Non-structural proteins） 103.1. 非結構性蛋白3（Non-structural proteins 3） 113.2. 類木瓜蛋白酶（Papain-like protease） 113.3. 嚴重急性呼吸道病毒–一型獨特蛋白結構域（SARS-CoV-1 unique domain） 123.4. 3–凝乳蛋白樣酶（3-chymotrypsin-like protease） 133.5. RNA依賴性RNA聚

合酶（RNA-dependent RNA polymerase） 134. 結構蛋白（Structural proteins） 144.1. 刺突蛋白（Spike protein） 144.2. 套膜蛋白（Envelope protein） 154.3. 膜蛋白（Membrane protein） 154.4. 核殼蛋白（Nucleocapsid protein） 155. 輔助蛋白 (Accessory proteins) 16第六節、 SARS-CoV-1與2的感染及複製機制（Infection and life cycle of SARS-CoV-1 and

2）……………………………………………………………………………………….. 161. SARS-CoV-1的感染（Infection of SARS-CoV-1） 162. SARS-CoV-2的感染（Infection of SARS-CoV-2） 173. SARS-CoV-1與2的複製機制（Replication of SARS-CoV-1 and 2） 18第七節、 嚴重急性呼吸道症候群與嚴重特殊傳染性肺炎-2019的臨床症狀（Clinical features of SARS and COVID-19） 181. 嚴重急性呼吸道症候群的臨床特徵 （Clinical

features of SARS） 182. 嚴重特殊傳染性肺炎-2019的臨床特徵 （Clinical features of COVID-19） 19第八節、 免疫反應（Immune response） 201. 細胞激素風暴 （Cyokine strom） 202. 類鐸受體（Toll-like receptors） 212. RIG樣受體（RIG-I-Like receptors） 223. NOD樣受體（Nucleotide oligomerization domain-like receptors） 224. NLRP3發炎小體（NLRP3 infla

mmasome） 235. 細胞激素（Cytokines） 245.1. 介白素-1β（Interleukin-1β） 245.2. 介白素-6 （Interleukin-6） 255.3. 趨化激素CXC motif chemokine 10 255.4. 乙型-轉型生長因子（Transforming growth factor-beta） 26第九節、 嚴重急性呼吸道症候群病毒第二型的預防與治療（Prevention and treatment of SARS-CoV-2） 271. 疫苗（Vaccines） 272. 藥物（Drugs） 28第十節、

病毒樣顆粒（Virus-like particle, VLP） 29第十一節、 病毒複製子（viral replicon） 30第十二節、 單次感染性顆粒（Single round infectious particle） 31第二章、 研究動機、目的及實驗設計 33第一節、 探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒的獨特結構域誘導NLRP3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLRP3 Inflammasome-Depen

dent CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 331. 研究動機（Motive） 332. 研究目的 （Aim） 343. 實驗設計 （Experimental design） 353.1. 探討SARS-CoV-1 SUD誘導細胞發炎反應（Investigation of inflammatory response induced by SARS-CoV-1 SUD） 353.2. 探討SARS-CoV-1 SUD誘導小鼠肺發炎反應（Investigation of pneumonia induced by SARS-CoV-1

SUD in mice） 35第二節、 SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Induction of pulmonary inflammation by SARS-CoV-2 Virus-like particle and Single round infectious particle） 361. 研究動機（Motive） 362. 研究目的（Aim） 373. 實驗設計（Experimental design） 383.1. SARS-CoV-2單次感染性顆粒製備（Preparation of SARS-CoV-2 SRIP） 38

3.2. 評估SARS-CoV-1 and 2單次感染性顆粒誘導肺部致病機制（Assessing the pathogenesis of SARS-CoV-2 SRIP） 383.3. 分析SOmiEM/CoV-2 SRIP在中和試驗之敏感性（Analyzing sensitivity of SOmiEM/CoV-2 SRIP for neutralization assay） 39第三章、 實驗材料與方法（METERIAL AND METHOD） 40第一節、 實驗材料（Meterial） 40第二節、 實驗方法（一）：探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒的獨特結構域誘導NLR

P3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLRP3 Inflammasome-Dependent CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 481. 細胞株 (Cell strain) 482. SARS-CoV-1 SUD與子結構域質體的構築（Construction of SARS-CoV-1 SUD and sub-domain plasmid） 483. 聚合酶連鎖反應（Po

lymerase chain reaction, PCR） 494. 聚合酶連鎖反應產物純化（PCR products purification） 495. 限制酶酵素反應（Restriction enzyme digestion） 506. DNA接合（DNA ligation） 507. 質體轉型（Plasmid transformation） 508. 菌落篩選（Colony screening） 519. CXCL10報導基因質體（CXCL10 repoter plasmids） 5110. 質體純化（Plasmid purification） 5111.

SARS-CoV-1複製子萃取（SARS-CoV-1 repicon extraction） 5212. 短暫轉染（Transient transfection） 5313. 建立SUD穩定表達細胞株（Establishment of SUD expressing cell line） 5314. 萃取細胞內與肺臟組織總核醣核酸（Extraction of cell and lung tissues total RNA） 5315. 即時定量聚合酶連鎖反應（Quantitative real time polymerase chain reaction, q-PCR）………

…………………………………………………………………………………………… 5416. 雙冷光素酶報導基因檢測（Dual-Luciferase Reporter Assay） 5517. 免疫螢光染色（Immunofluorescence staining） 5518. 間接-酵素連結免疫吸附分析法（indirect enzyme-linked immunosorbent assay） 5619. 西方墨點法（Western blot）與斑點印跡法 （dot-blot） 5620. 小鼠動物模型（Animal model） 5721. 流式細胞儀分析（Flow cytome

try assay） 5822. 組織病理學與免疫組織化學染色分析（Histopathology and immunohistochemistry assays）…………………………………………………………………………………………………. 5823. NLRP3抑制劑處理（NLRP3 inhibitor treatment） 5924. 統計分析（Statistical analysis） 59第三節、 實驗方法二：SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Induction of pulmonary inflammation by SARS-CoV

-2 Virus-like particle and Single round infectious particle） 601. 細胞株 (Cell lines) 602. SARS-CoV-2 SWH1EM與SOmiEM質體的構築（Construction of SARS-CoV-2 SWH1EM and SOmiEM plasmid） 603. SARS-CoV-2病毒樣顆粒的生產與濃縮（Production and concentration of SARS-CoV-2 VLP）…………………………………………………………………………………………………… 614. 反轉

錄-即時定量聚合酶連鎖反應（Reverse transcription-Quantitative real time polymerase chain reaction, RT-qPCR） 625. 西方墨點法（Western blot） 636. 穿透式電子顯微鏡 （Transmission electron microscope, TEM） 647. 單次感染性感染顆粒的生產（Production of single round infectious particle） 648. 冷光酶分析（Luciferase assay） 649. SARS-CoV-1與2單次感染

性感染顆粒的感染（Infection of SARS-CoV-1 and 2 SRIP）…………………………………………………………………………………………………... 6510. Remdesivir與GC376抑制SRIP活性試驗（Inhibition of SARS-CoV-2 SRIP by Remdesivir and GC376） 6511. 疫苗免疫血清分析SWH1EM與SOmiEM VLP之抗原性 （Antigenicity of SARS-CoV-2 VLP by immunized serum） 6612. SOmiEM/CoV-2 SRIP之疫苗免疫血清中和能

力（Neutralization of SARS-CoV-2 SRIP by immunized serum） 6613. 免疫螢光染色（Immunofluorescence staining） 66第四章、 結果 (RESULTS) 68第一節、 結果一（Result 1）：探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒的獨特結構域誘導NLRP3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLRP3 Inflammasome-Depende

nt CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 681. SARS-CoV-1-SUD誘導人肺上皮細胞中趨化激素的表達 681.1. 建立SARS-CoV-1 SUD質體與人肺上皮細胞中的表達 681.2. SUD-MC子結構域上調人肺上皮細胞中CXCL10的表達 691.3. SUD-MC子結構域活化AP1介導的CXCL10表達機制 702. SARS-CoV-1 SUD誘導小鼠模型肺部發炎 712.1. 透過氣管滴入SUD質體誘導小鼠肺部發炎反應 712.2. SUD-MC誘導小鼠肺部細胞激素與趨化激素之表現 732.3.

SUD-MC活化NLRP3發炎體介導CXCL10在肺發炎的表現 74第二節、 結果二（Result 2）：SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Mechanism of pulmonary inflammation in SARS-CoV-2 Virus-like particle and Single round infectious particle） 761. 構築SARS-CoV-2 S-E-M表達質體 762. 製造SARS-CoV-1與2單次感染性顆粒 773. SARS-CoV-1與2的單次感染性顆粒之感染力 784. 評估

SWH1EM/CoV-2 rep SRIP發展抗病毒藥物篩選平台之敏感性 795. 分析SWH1EM/CoV-1 rep SRIP與SWH1EM/CoV-2 rep SRIP誘導人類肺細胞（calu-3）發炎……………………………………………………………………………………………………… 806. 篩選抗SWH1EM/CoV-1 rep SRIP與SWH1EM/CoV-2 rep SRIP之潛力藥物 817. 評估疫苗免疫血清對SOmiEM/CoV-2 rep SRIP的中和能力 82第五章、 討論（Discussion） 84第一節、 討論一（Discussion 1）：探

討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒-1的獨特結構域誘導NLRP3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLRP3 Inflammasome-Dependent CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 84第二節、 討論二（Discussion 1）：SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Induction of pulmonary inflammation by

SARS-CoV-2 Virus-like particle and Single round infectious particle） 87第六章、 結論與未來展望（CONCLUSION AND FUTURE PROSPECTS） 90第一節、 結論（Conclusion） 901. 結論一（Conclusion 1）：探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒的獨特結構域誘導NLRP3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLR

P3 Inflammasome-Dependent CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 902. 結論二（Conclusion 2）：SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Mechanism of pulmonary inflammation in SARS-CoV-2 Virus-like particle and Single round infectious particles） 91第二節、 未來展望（ Future prospects） 91