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奈米微粒分散暴露及其定量危害風險評估研究ILOSH104-A312

為了解決肺發炎的問題，作者陳正堯,蔡春進 這樣論述：

　　本研究以一套可以產生穩定濃度並長時間穩定的震盪流體化床-噴霧粉體分散器(Shaker-Fluidized bed-Atomizer disperser, SFA)分散系統分散奈米碳管(carbon nano tube, CNT)與純化奈米碳管(purified carbon nano tube, PCNT)進行細胞株毒性暴露試驗與動物吸入性暴露試驗。實驗前先量測奈米碳管經分散後的各種物化特性如數目濃度分布、質量濃度分布、即時質量濃度、即時表面積濃度及形貌等，除此之外也量測奈米碳管純化前後的純度分析以及官能基改變。結果顯示，PCNT的質量中間氣動直徑MMAD (mass

median aerodynamic diameters, MMAD)較CNT小，並且在純化後有羧基(-COOH)官能基的出現。 為了探討奈米物質對細胞株的影響，研究開發了一套更能真實模擬動物呼吸系統細胞暴露情形的靜電式氣液介面暴露腔(Electrostatic Precipitator Air-Liquid-Interface exposure chamber, ESP-ALI exposure chamber)，並且將該系統與SFA分散系統結合，分別以傳統懸浮液法及ALI暴露法將人類肺腺癌細胞A549 (human lung adenocarcinoma cells, A549)與小鼠巨噬

細胞RAW264.7 (Macrophage Cells, RAW264.7)細胞暴露於不同劑量的CNT及PCNT。細胞存活率與各項發炎指標分析結果顯示，ALI暴露法造成的細胞毒性反應均明顯高於傳統方法，並且PCNT的毒性也高CNT，這是因為PCNT的MMAD較CNT小，且其分散情形較CNT良好所導致。 動物實驗部分以SFA分散系統與奈米微粒暴露腔系統(Nanoparticle Exposure Chamber System, NECS)結合，進行每天4小時，持續5天的高濃度CNT、低濃度CNT及低濃度PCNT的三組小鼠暴露實驗，並在暴露完成後的第3天進行各項生理、血液生化及病理檢驗。結果顯示

，各組暴露後造成肺功能變化的嚴重程度依序為高濃度CNT >低濃度CNT>低濃度PCNT，並且由病理組織分析可以看出高濃度CNT的暴露組有明顯的肺發炎、肺泡壁增厚與類似間質性肺炎的情形。PCNT因分散特性較CNT良好，在小鼠肺部有最高的沉積量，然而並未造成最嚴重的生物效應，可能原因為PCNT的分散性佳且被許多呼吸道表面的蛋白質所包圍，一週的動物暴露實驗及短期的追蹤觀察，尚不足以表現生物效應症狀。

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以反向基因工程探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒第一與二型之分子致病機制：分析NLRP3/CXCL10介導發炎反應及高關注變異株感染力

為了解決肺發炎的問題，作者張勇昇 這樣論述：

致謝 I中文摘要 IIABSTRACT IV目錄 VI圖表目錄 XI第一章、 文獻探討 1第一節、 緒論 1第二節、 冠狀病毒屬（Coronavirus genus） 21. 甲型–冠狀病毒（Alpha-coronavirus, α-CoV） 22. 乙型–冠狀病毒（Beta-coronavirus, β-CoV） 33. 丙型–冠狀病毒（Gamma-coronavirus, γ-CoV） 34. 丁型–冠狀病毒（Delta-coronavirus, δ-CoV） 3第三節、 人類冠狀病毒的流行病學（Epidemiology of human coro

navirus） 41. 嚴重急性呼吸道綜合症冠狀病毒–一型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-1, SARS-CoV-1） 42. 中東呼吸道綜合症冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV）…………………………………………………………………………………………………….. 53. 嚴重急性呼吸道綜合症冠狀病毒–二型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2, SARS-CoV-2） 63.1.

SARS-CoV-2高度關注變異株（Variants of Concern,VOCs） 6第四節、 人類冠狀病毒的傳播（Transmission of human coronavirus） 8第五節、 SARS-CoV-1與2的結構與基因組 （Structure and genome of SARS-CoV-1 and 2）…………………………………………………………………………………………… 91. 結構（Structure） 92. 基因組（Genome） 93. SARS-CoV-1與SARS-CoV-2基因組的差異（Sequence identity of SA

RS-CoV-1 and 2）……………………………………………………………………………………………………….. 104. 非結構性蛋白（Non-structural proteins） 103.1. 非結構性蛋白3（Non-structural proteins 3） 113.2. 類木瓜蛋白酶（Papain-like protease） 113.3. 嚴重急性呼吸道病毒–一型獨特蛋白結構域（SARS-CoV-1 unique domain） 123.4. 3–凝乳蛋白樣酶（3-chymotrypsin-like protease） 133.5. RNA依賴性RNA聚

合酶（RNA-dependent RNA polymerase） 134. 結構蛋白（Structural proteins） 144.1. 刺突蛋白（Spike protein） 144.2. 套膜蛋白（Envelope protein） 154.3. 膜蛋白（Membrane protein） 154.4. 核殼蛋白（Nucleocapsid protein） 155. 輔助蛋白 (Accessory proteins) 16第六節、 SARS-CoV-1與2的感染及複製機制（Infection and life cycle of SARS-CoV-1 and

2）……………………………………………………………………………………….. 161. SARS-CoV-1的感染（Infection of SARS-CoV-1） 162. SARS-CoV-2的感染（Infection of SARS-CoV-2） 173. SARS-CoV-1與2的複製機制（Replication of SARS-CoV-1 and 2） 18第七節、 嚴重急性呼吸道症候群與嚴重特殊傳染性肺炎-2019的臨床症狀（Clinical features of SARS and COVID-19） 181. 嚴重急性呼吸道症候群的臨床特徵 （Clinical

features of SARS） 182. 嚴重特殊傳染性肺炎-2019的臨床特徵 （Clinical features of COVID-19） 19第八節、 免疫反應（Immune response） 201. 細胞激素風暴 （Cyokine strom） 202. 類鐸受體（Toll-like receptors） 212. RIG樣受體（RIG-I-Like receptors） 223. NOD樣受體（Nucleotide oligomerization domain-like receptors） 224. NLRP3發炎小體（NLRP3 infla

mmasome） 235. 細胞激素（Cytokines） 245.1. 介白素-1β（Interleukin-1β） 245.2. 介白素-6 （Interleukin-6） 255.3. 趨化激素CXC motif chemokine 10 255.4. 乙型-轉型生長因子（Transforming growth factor-beta） 26第九節、 嚴重急性呼吸道症候群病毒第二型的預防與治療（Prevention and treatment of SARS-CoV-2） 271. 疫苗（Vaccines） 272. 藥物（Drugs） 28第十節、

病毒樣顆粒（Virus-like particle, VLP） 29第十一節、 病毒複製子（viral replicon） 30第十二節、 單次感染性顆粒（Single round infectious particle） 31第二章、 研究動機、目的及實驗設計 33第一節、 探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒的獨特結構域誘導NLRP3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLRP3 Inflammasome-Depen

dent CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 331. 研究動機（Motive） 332. 研究目的 （Aim） 343. 實驗設計 （Experimental design） 353.1. 探討SARS-CoV-1 SUD誘導細胞發炎反應（Investigation of inflammatory response induced by SARS-CoV-1 SUD） 353.2. 探討SARS-CoV-1 SUD誘導小鼠肺發炎反應（Investigation of pneumonia induced by SARS-CoV-1

SUD in mice） 35第二節、 SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Induction of pulmonary inflammation by SARS-CoV-2 Virus-like particle and Single round infectious particle） 361. 研究動機（Motive） 362. 研究目的（Aim） 373. 實驗設計（Experimental design） 383.1. SARS-CoV-2單次感染性顆粒製備（Preparation of SARS-CoV-2 SRIP） 38

3.2. 評估SARS-CoV-1 and 2單次感染性顆粒誘導肺部致病機制（Assessing the pathogenesis of SARS-CoV-2 SRIP） 383.3. 分析SOmiEM/CoV-2 SRIP在中和試驗之敏感性（Analyzing sensitivity of SOmiEM/CoV-2 SRIP for neutralization assay） 39第三章、 實驗材料與方法（METERIAL AND METHOD） 40第一節、 實驗材料（Meterial） 40第二節、 實驗方法（一）：探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒的獨特結構域誘導NLR

P3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLRP3 Inflammasome-Dependent CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 481. 細胞株 (Cell strain) 482. SARS-CoV-1 SUD與子結構域質體的構築（Construction of SARS-CoV-1 SUD and sub-domain plasmid） 483. 聚合酶連鎖反應（Po

lymerase chain reaction, PCR） 494. 聚合酶連鎖反應產物純化（PCR products purification） 495. 限制酶酵素反應（Restriction enzyme digestion） 506. DNA接合（DNA ligation） 507. 質體轉型（Plasmid transformation） 508. 菌落篩選（Colony screening） 519. CXCL10報導基因質體（CXCL10 repoter plasmids） 5110. 質體純化（Plasmid purification） 5111.

SARS-CoV-1複製子萃取（SARS-CoV-1 repicon extraction） 5212. 短暫轉染（Transient transfection） 5313. 建立SUD穩定表達細胞株（Establishment of SUD expressing cell line） 5314. 萃取細胞內與肺臟組織總核醣核酸（Extraction of cell and lung tissues total RNA） 5315. 即時定量聚合酶連鎖反應（Quantitative real time polymerase chain reaction, q-PCR）………

…………………………………………………………………………………………… 5416. 雙冷光素酶報導基因檢測（Dual-Luciferase Reporter Assay） 5517. 免疫螢光染色（Immunofluorescence staining） 5518. 間接-酵素連結免疫吸附分析法（indirect enzyme-linked immunosorbent assay） 5619. 西方墨點法（Western blot）與斑點印跡法 （dot-blot） 5620. 小鼠動物模型（Animal model） 5721. 流式細胞儀分析（Flow cytome

try assay） 5822. 組織病理學與免疫組織化學染色分析（Histopathology and immunohistochemistry assays）…………………………………………………………………………………………………. 5823. NLRP3抑制劑處理（NLRP3 inhibitor treatment） 5924. 統計分析（Statistical analysis） 59第三節、 實驗方法二：SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Induction of pulmonary inflammation by SARS-CoV

-2 Virus-like particle and Single round infectious particle） 601. 細胞株 (Cell lines) 602. SARS-CoV-2 SWH1EM與SOmiEM質體的構築（Construction of SARS-CoV-2 SWH1EM and SOmiEM plasmid） 603. SARS-CoV-2病毒樣顆粒的生產與濃縮（Production and concentration of SARS-CoV-2 VLP）…………………………………………………………………………………………………… 614. 反轉

錄-即時定量聚合酶連鎖反應（Reverse transcription-Quantitative real time polymerase chain reaction, RT-qPCR） 625. 西方墨點法（Western blot） 636. 穿透式電子顯微鏡 （Transmission electron microscope, TEM） 647. 單次感染性感染顆粒的生產（Production of single round infectious particle） 648. 冷光酶分析（Luciferase assay） 649. SARS-CoV-1與2單次感染

性感染顆粒的感染（Infection of SARS-CoV-1 and 2 SRIP）…………………………………………………………………………………………………... 6510. Remdesivir與GC376抑制SRIP活性試驗（Inhibition of SARS-CoV-2 SRIP by Remdesivir and GC376） 6511. 疫苗免疫血清分析SWH1EM與SOmiEM VLP之抗原性 （Antigenicity of SARS-CoV-2 VLP by immunized serum） 6612. SOmiEM/CoV-2 SRIP之疫苗免疫血清中和能

力（Neutralization of SARS-CoV-2 SRIP by immunized serum） 6613. 免疫螢光染色（Immunofluorescence staining） 66第四章、 結果 (RESULTS) 68第一節、 結果一（Result 1）：探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒的獨特結構域誘導NLRP3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLRP3 Inflammasome-Depende

nt CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 681. SARS-CoV-1-SUD誘導人肺上皮細胞中趨化激素的表達 681.1. 建立SARS-CoV-1 SUD質體與人肺上皮細胞中的表達 681.2. SUD-MC子結構域上調人肺上皮細胞中CXCL10的表達 691.3. SUD-MC子結構域活化AP1介導的CXCL10表達機制 702. SARS-CoV-1 SUD誘導小鼠模型肺部發炎 712.1. 透過氣管滴入SUD質體誘導小鼠肺部發炎反應 712.2. SUD-MC誘導小鼠肺部細胞激素與趨化激素之表現 732.3.

SUD-MC活化NLRP3發炎體介導CXCL10在肺發炎的表現 74第二節、 結果二（Result 2）：SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Mechanism of pulmonary inflammation in SARS-CoV-2 Virus-like particle and Single round infectious particle） 761. 構築SARS-CoV-2 S-E-M表達質體 762. 製造SARS-CoV-1與2單次感染性顆粒 773. SARS-CoV-1與2的單次感染性顆粒之感染力 784. 評估

SWH1EM/CoV-2 rep SRIP發展抗病毒藥物篩選平台之敏感性 795. 分析SWH1EM/CoV-1 rep SRIP與SWH1EM/CoV-2 rep SRIP誘導人類肺細胞（calu-3）發炎……………………………………………………………………………………………………… 806. 篩選抗SWH1EM/CoV-1 rep SRIP與SWH1EM/CoV-2 rep SRIP之潛力藥物 817. 評估疫苗免疫血清對SOmiEM/CoV-2 rep SRIP的中和能力 82第五章、 討論（Discussion） 84第一節、 討論一（Discussion 1）：探

討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒-1的獨特結構域誘導NLRP3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLRP3 Inflammasome-Dependent CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 84第二節、 討論二（Discussion 1）：SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Induction of pulmonary inflammation by

SARS-CoV-2 Virus-like particle and Single round infectious particle） 87第六章、 結論與未來展望（CONCLUSION AND FUTURE PROSPECTS） 90第一節、 結論（Conclusion） 901. 結論一（Conclusion 1）：探討嚴重急性呼吸道症侯群冠狀病毒的獨特結構域誘導NLRP3在CXCL10介導肺部發炎的依賴性（SARS Unique Domain (SUD) of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Induces NLR

P3 Inflammasome-Dependent CXCL10-Mediated Pulmonary Inflammation） 902. 結論二（Conclusion 2）：SARS-CoV-2病毒樣顆粒與單次感染性病毒顆粒製備及其誘導肺發炎（Mechanism of pulmonary inflammation in SARS-CoV-2 Virus-like particle and Single round infectious particles） 91第二節、 未來展望（ Future prospects） 91