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利用植物生產降血脂活性胜肽 VVYP 之研究 : 以攜有 VVYP 之大豆改造蛋白基因 Gy5 之轉殖分析

為了解決大豆胜肽ptt的問題，作者賴彥勳 這樣論述：

活性胜肽 Val-Val-Tyr-Pro (VVYP) 為抑制腸道吸收三酸甘油酯之重要因子，其可經由促進肝臟 HTGL (hepatic triglyceride lipase) 之活性來降低三酸甘油酯之濃度達到降血脂之作用。本研究透過基因工程改造大豆儲藏性蛋白基因 Gy5，使其攜帶有 10 套降血脂活性胜肽 VVYP 之胺基酸序列，透過農桿菌轉殖技術，將含有 VVYP 之 Gy5 基因分別轉殖大豆及稻米，使其能大量表現帶有 VVYP 之 Gy5 基因，希望透過食用含 VVYP 之稻米及大豆，經由消化道酵素分解、吸收後，達到降血脂之功效，可大幅提高稻米及大豆之附加價值。轉殖水稻部分，利用水稻

種子專一性 Glutelin 啟動子；轉殖大豆部分，利用大豆種子專一性 β-conglycinin α-subunit 啟動子 (BCAP) 及持續性表現 CaMV35S 啟動子，驅動降血脂活性胜肽 VVYP 10 套之胺基酸序列。另外透過人工合成 miRNA159-Gy5 (artificial microRNA)，針對大豆內生性 Gy5 基因進行靜默，希望能抑制其原有之儲藏性蛋白 Gy5 之表現，使改造過之外來基因 Gy5-10VVYP 之表現量增加。由於大豆轉殖的困難，本研究也擬建立一個較完善、適用於本土大豆品種青仁烏豆 (Chin-Ren-Woo-Dow, CRWD) 之轉殖平台，因此

針對本研究室建立之轉殖系統進行下胚軸培殖體再生測試、殺草劑 Phosphinothricin (PTT) 濃度篩選及農桿菌轉殖條件測試，並嘗試利用基因槍 (particle bombardment) 系統進行轉殖，希望能建立較完善之大豆轉殖系統。但目前仍未獲得任何大豆轉殖株。轉殖水稻部分，目前已獲得之 28 株 GluGy5VP10 水稻再生植株，經 PCR 確認，皆為轉殖株。經南方墨點法分析轉殖基因套數，大部份水稻轉殖株含有 1 或 2 套插入基因。以西方墨點法分析種子蛋白表現，在接近 60 kDa、50 kDa 、40 kDa、20 kDa 位置之蛋白，皆可被 Gy5、Anti-6X Hi

s tag 抗體所辨識，進一步利用液相層析-串聯質譜儀 (LC-MS/MS) 進行蛋白身分鑑定，在接近 60 kDa、50 kDa、20 kDa 位置之蛋白，可比對到Gy5-10VVYP 或 大豆 Glycinin 5 (Gy5) 蛋白。由以上結果確認 GlyGy5VP10 轉殖水稻種子可表現 Gy5-10VVYP。最後進一步針對水稻外源蛋白 Gy5-10VVYP 進行大量萃取純化，以利後續試驗確認 Gy5-10VVYP 可釋放出 VVYP 胜肽片段，並以動物試驗檢測其是否具有降血脂之功效。

利用轉殖植物生產VVYP活性胜肽及特殊胺基酸組成RMGK之研究

為了解決大豆胜肽ptt的問題，作者林家夙 這樣論述：

本研究利用基因工程技術，以大豆為生物反應器大量表現活性胜肽VVYP及特殊胺基酸RMGK。活性胜肽VVYP (Val-Val-Tyr-Pro)具有降低三酸甘油脂的能力進而抑制脂肪的吸收，能有效抑制血液中三酸甘油脂的含量，減少心血管疾病的發生。在許多的雜食性淡水魚類養殖生產中，飼料配方主要來自大豆的原料已有多年的歷史，利用大豆粉取代較為昂貴的魚粉，可大幅降低魚產品的生產成本。然而與魚粉成份相比較，methionine與lysine是大豆產品中含量較缺乏的胺基酸，因此可利用基因工程在大豆基因組中加入這些胺基酸，並添加glycine及arginine增加魚類對大豆粉的嗜口性及提高魚類對疾病的抵抗性。

已知固殺草 (phosphinothricin, PTT)可抑制植物體行光合及光呼吸作用而導致植物體死亡。因此本研究將選用抗PTT之bar作為篩選基因，建立大豆轉殖phosphinothricin篩選系統，以利大豆轉殖株之篩選，經由統計分析，6 及5 mg/L PTT分別為再生芽體及轉殖株後代最適當之篩選濃度。目前已經藉由農桿菌轉殖獲得135株大豆再生植株，然而以PCR及南方點墨法確認僅有一株再生植株含有轉殖基因Gy5-10RMGK，且其轉殖基因無法順利遺傳到下一代。到目前為止，由於大豆轉殖技術尚無法突破，無法得知含有VVYP及RMGK之構築是否能於植物體正常表現外源性蛋白，因此先將這些構築轉

殖至水稻，進一步分析外源蛋白的表現情形，以確認此策略之可行性。利用持續性表現之35S 啟動子，構築含活性胜肽之Gy5-10VVYP及含特殊胺基酸之Gy1-10RMGK載體，藉由農桿菌進行水稻轉殖，本研究室總共獲得16株35S-Gy5-10VVYP及20株35S-Gy1-10RMGK水稻轉殖株，以PCR及南方點墨法確認這些轉殖水稻皆含轉殖基因，並以西方點墨法分析葉片及種子蛋白，確認這些轉殖水稻皆可表現重組蛋白Gy5-10VVYP或Gy1-10RMGK。